Sekwencjonowanie nowej generacji jako narzędzie w rozstrzyganiu kwestii ewolucyjnych i filogeograficznych na przykładzie krytycznego rodzaju Oenothera L. (Onagraceae)
Streszczenie
Wywodzący się z Ameryki Północnej rodzaj Oenothera (wiesiołek) skupia szereg taksonów o niejasnej filogenezie i nieustalonym statusie taksonomicznym. Dotyczy to szczególnie licznych taksonów powstałych w Europie na skutek wtórnego kontaktu ancestralnych gatunków amerykańskich i/lub hybrydyzacji form amerykańskich z rodzimymi gatunkami europejskimi. Ponadto, unikatowe połączenie szeregu cech, takich jak: tworzenie się pierścieni chromosomowych w trakcie mejozy skutkujące rozległym sprzężeniem genów, oburodzicielskie dziedziczenie plastydów oraz szeroka zdolność do hybrydyzacji z zachowaniem płodności powstających mieszańców sprawiło, że wiesiołki to od przeszło stu lat organizmy modelowe w badaniach genetycznych i cytogenetycznych. Jednocześnie, rodzaj Oenothera to odrębny model również w analizach ewolucyjno-filogeograficznych, którego badania przyczyniły się do poszerzenia naszej wiedzy na temat m.in. hybrydyzacji, procesu powstawania gatunków (specjacji) oraz koewolucji plastomowo-genomowej.
Celem projektu jest przeprowadzenie wstępnych badań wybranych gatunków z rodzaju Oenothera z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji – RADseq (ang. Restriction-site-Associated DNA sequencing). Nowoczesne sekwencjonowanie, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych do niedawna metod takich jak AFLP czy mikrosatelity, jest narzędziem stosunkowo niedrogim, mniej czasochłonnym i czułym, pozwalającym na szybkie otrzymanie setek lub nawet tysięcy polimorficznych markerów molekularnych, umożliwiających wykrycie potencjalnego zróżnicowania w obrębie bardzo zbliżonych taksonów, a nawet populacji. Dotychczas, badania z zastosowaniem sekwencjonowania RAD okazały się kluczowe w rozstrzyganiu niejasnych kwestii filogenetycznych w wielu grupach roślin i zwierząt. Planowany projekt pozwoli wykazać, na ile metoda RADseq okaże się przydatna w badaniach nad ewolucją i filogenezą krytycznych taksonów Oenothera.
Do przeprowadzenia planowanych badań wybrane zostaną 2-4 blisko spokrewnione taksony Oenothera o niejasnej pozycji systematycznej (np. O. biennis; po 3-6 szczepów z różnych regionów geograficznych) oraz, dla celów porównawczych, dwa inne, znacznie bardziej odległe gatunki (np. O. elata i O. grandiflora). Pierwszy etap projektu - pobranie materiału badawczego w postaci młodych liści i standardowa izolacja jądrowego DNA – zostaną przeprowadzone w Instytucie Maxa Plancka w Golm koło Poczdamu (Niemcy). Kierownik tamtejszego zespołu badawczego, skupiającego się na badaniach genetyki i ewolucji gatunków z rodzaju Oenothera – Dr Stephan Greiner – dysponuje unikatową w skali Europy hodowlą obejmującą kilkaset szczepów wiesiołków, a także odpowiednim zapleczem laboratoryjnym.
Drugi etap, a więc właściwe sekwencjonowanie wyizolowanego DNA oraz analiza i interpretacja otrzymanych wyników, przeprowadzony zostanie w laboratorium molekularnym Instytutu Botaniki PAN w Krakowie, z zastosowaniem sekwenatora firmy Illumina HiSeq. Przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych, DNA zostanie pocięty na bardzo liczne, krótkie fragmenty, które następnie zostaną powielone za pomocą reakcji PCR i porównane. W ten sposób możliwe będzie wykrycie potencjalnie licznych, stosunkowo niewielkich różnic w sekwencjach nukleotydów (SNP; ang. Single Nucleotide Polymorphism) pomiędzy i/lub w obrębie taksonów. Otrzymane dane zostaną następnie szczegółowo opracowane przy pomocy odpowiednich narzędzi bioinformatycznych. Ostateczne rezultaty pozwolą na wnioskowanie na ile nowoczesne metody sekwencjonowania typu RADseq okażą się odpowiednim narzędziem w badaniach nad ewolucją, filogenezą oraz współczesnym zróżnicowaniem wiesiołków.